¿Cómo medir la autofagia en la actualidad?

Comencemos explicando qué es la autofagia.

La autofagia es un proceso celular que consiste en “comerse a uno mismo”. Se trata de degradar las moléculas (proteínas, mitocondrias dañadas…) a través de las enzimas contenidas en los lisosomas. Los productos derivados de esta descomposición, principalmente, se reciclan para procesos celulares importantes, sobre todo en periodos de estrés o ayuno.

Ilustración 1: Proceso de autofagia en Caenoharbditis elegans, de http://wormbook.org/chapters/www_autophagy/autophagy.html

El tema que abordamos hoy en esta entrada del blog es entender cómo se mide la autofagia. Pues existen diversas metodologías para investigar la activación, inhibición o alteración del flujo autofágico, y cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas, por lo que se recomienda usar técnicas complementarias. Estos métodos siguen la formación y acumulación de autofagosomas, así como su fusión con los lisosomas y la degradación de su contenido en las mismas. Las principales metodologías en uso para estudiar la autofagia son:

• Técnicas bioquímicas:

• • Análisis LC3: La proteína LC3 (microtubule-associated protein light chain 3) es escindida por la acción de ATG4 (atg son genes relacionados con la autofagia que se transcriben en proteínas ATG), generándose la forma activa LC3-I en el citosol. Posteriormente, al LC3-I se incorpora lípidos por la acción de ATG7 y ATG3 que catalizan su unión a los residuos de fosfadiletanolamina presentes abundantemente en la membrana del fagóforo convirtiéndose en LC3-II. Esta unión al fogóforo es fundamental para el cierre de la vesícula y dar lugar al autofagosoma. Una vez formado el autofagosoma, se libera LC3-II de la membrana externa y puede ser cuantificado. A través de un Western blot es posible detectar y cuantificar los niveles de LC3-II, donde un aumento en LC3-II en realción con LC3-I sugiere una mayor actividad autofágica.

Ilustración 2: Génesis, desarrollo y término de una vacuola autofágica y participación de las diferentes proteínas ATG en estas etapas.

• • Análisis p62/SQSTM1: En la autofagia selectiva, la carga citoplásmica se reconoce a través de interacciones con proteínas receptoras específicas. Este proceso catabólico selectivo está mediado a través de la proteína de mamífero p62/sequestosoma 1 (SQSTM1). p62 es una proteína que se une a genes de la familia ATG y funciona como receptor de carga para proteínas destinadas a la autofagia, degradándose también con ellos en el último paso del proceso. Por lo tanto, su acumulación indica una reducción en la actividad autofágica. La cuantificación de p62 mediante Western blot puede ser utilizada para evaluar la tasa de flujo autofágico. Es decir, cuanto menos p62 aparece en los Western blot, más inducción a la autofagia se está produciendo en esas células.

• Técnicas morfológicas:
  • Microscopía electrónica: Es la técnica considerada como “gold standard” en el estudio de la autofagia. Podemos visualizar a nivel subcelular los compartimentos formados durante la autofagia y es posible identificar los autofagosomas como una vesícula rodeada de una doble membrana, además de identificar el origen del cargo a degradar que contienen. Sin embargo, este método permite únicamente una evaluación a un solo tiempo de un proceso altamente dinámico, por lo que la evaluación de distintas muestras a distintos tiempos es necesaria.

• • Microscopía fluorescencia: La inmunocitoquímica y la inmunofluorescencia podemos usarla para determinar la localización de distintos orgánulos o proteínas que actúan en los compartimentos autofagosomales y lisosomas en las células para observar su trayectoria y degradación a través de la autofagia. Podemos usar anticuerpos específicos de LC3 o contra otras proteínas mitocondriales, lisosomales o de los peroxisomas. Su visualización a través del microscopio con focal determina la localización de las proteínas o compartimentos gracias al solapamiento de las señales de los fluoróforos. Estas técnicas se han ido adaptando a la citometría de flujo, que nos permite un análisis más cuantitativo del evento de la autofagia.

• Técnicas moleculares:
  • Análisis de flujo de autofagia:  Consiste en medir la dinámica de la autofagia utilizando inhibidores y activadores de la autofagia en presencia de marcadores como LC3 y p62. Los cambios en sus niveles después de tales tratamientos pueden proporcionar información sobre el flujo autofágico.

• • Análisis genético: Existen más de 40 genes relacionados con la autofagia (ATG), de los cuales, unos pocos son los llamados “centrales” que son los que se utilizan tanto por la macroautofagia no selectiva como por la selectiva. Estos genes están muy conservados en eucariotas, por lo que se puede estudiar la autofagia en muchos organismos más sencillos. A través de la PCR se pueden genotipar estos genes atg, separarlos por electroforesis tras la amplificación y evaluar su expresión.

Llevando todo esto a la práctica, en el contexto clínico, las muestras de tejido de biopsias o intervenciones quirúrgicas pueden ser examinadas utilizando las técnicas mencionadas para evaluar la actividad autofágica en diversas enfermedades, incluidas cáncer, enfermedades neurodegenerativas, patologías cardiovasculares y más.

Es crucial controlar la autofagia no solo en términos de su activación, sino también en cómo se completa el proceso (flujo de autofagia), para entender completamente su estado en la patología de interés ya que sabemos que la autofagia puede tener dos caras: protección o avance de diversas patologías.

Entender la actividad autofágica puede ayudar en el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades. Por ejemplo, la modulación de la autofagia está siendo explorada como estrategia terapéutica en enfermedades como el cáncer y trastornos metabólicos.

Cada una de estas técnicas tiene sus ventajas y limitaciones, y la elección de la técnica a menudo depende del tipo de muestra y del objetivo específico del estudio. La combinación de múltiples métodos es frecuentemente recomendada para obtener una evaluación completa de la actividad autofágica en un contexto clínico o de investigación.

Se ha detectado que muchas enfermedades crónicas y neurodegenerativas se relacionan con fallos en el proceso de autofagia, lo que ha llevado a considerar que este proceso puede contrarrestar las consecuencias negativas del envejecimiento. Y ¿Por qué es esto importante? Pues porque el ayuno promueve la autofagia y esto está relacionado a su vez con rutas asociadas a la regeneración celular (longevidad); aunando aquí conceptos tan importantes como la nutrición, los procesos celulares y el envejecimiento.

Bibliografía consultada a fecha 03/05/2024:

https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-85602016000300004

https://inta.uchile.cl/noticias/206994/longevidad-salud-y-ayuno-intermitente

http://hdl.handle.net/10651/60498